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Master 2 "Microbiologie, Environnement, Santé"
UPMC - MNHN

Action antibactérienne des huiles essentielles (expérience 3)

Certaines huiles essentielles sont réputées pour leur activité bactéricide (les bactéries sont tuées). L'activité bactéricide des huiles essentielles peut s'expliquer par le fait qu'elles vont  pouvoir traverser les membranes biologiques des bactéries et affecter le métabolisme cellulaire. Des fonctions vitales de la bactérie comme la respiration et l'équilibre ionique de la cellule vont être altérées. A l'activité bactéricide, s'ajoute également l'activité bactériostatique qui permet de limiter le développement et la multiplication des bactéries.

Certaines huiles essentielles contenant des esters terpéniques vont directement agir sur les foyers inflammatoires et d'autres, appelées hypérémie, vont accélérer l'apport des flux sanguins ainsi que l'arrivée des globules blancs et des leucocytes ce qui va donc conduire à une réduction de l'inflammation.

Dans  les expériences que nous avons réalisé à l'Observatoire Océanologique de Banyuls avec M. Intertaglia (voir son interview), nous avons cherché à vérifier le caractère bactériostatique des différentes huiles en notre possession (celles que nous avons fabriquées et celles que nous avons achetées dans le commerce). Dans une premier temps, nous avons réalisé des expérience d'inhibition de croissance en milieu liquide afin de classer la puissance bactériostatique de nos huiles. Dans un deuxième temps, nous avons réalisé des expérience sur milieu solide pour mesurer la sensibilité d'une bactérie aux huiles essentielles en combinaison ou non avec un antibiotique. Cette expérience, proche de l'antibiogramme, s'appelle un aromatogramme.

1. Expérience d'inhibition de croissance d'E. coli en milieu liquide

Mode opératoire

Afin de mesurer la concentration cellulaire à l’aide de la densité optique, nous disposons d’une microplaque contenant 96 puits. Chaque puits a été rempli par 200 µl de milieu de culture contenant des cellules d'E. coli au moyen d'une micropipette multicanaux (Figure 14).

Nous avons ensuite ajouter différents volumes de chaque huile essentielle (Figure 15). Dans la permière expérience nous avons ajouté 2,5 µL, 5 µL, 10 µL, 20 µL et enfin 40 µL. Dans la deuxième expérience, nous avons ajouter 0,05 µL ; 0,15 µL ; 0,45 µL et 1,35 µL. Pour la 2ème expérience, comme il n'est pas possible de prélever de si faibles volumes avec précision (les huiles sont visqueuse), nous avons dilué 10 fois les huiles dans une solution d'eau/ éthanol pour ensuite ajouter des volumes de 0,5 µl, 1,5 µl, 4,5 µl et 13,5 µl. Chaque volume d'huile essentielle a été testé dans 3 puits différents. Pour chaque expérience, nous n'avons rien ajouté dans 12 puits différents afin de suivre la croissance normale de la bactérie (puits "contrôles"). Pour la deuxième expérience, nous avions également des "contrôles" avec la même concentration d'éthanol qui a servis à diluer les huiles essentielles afin de s'assurer ce solvant en faible concentration n'avait pas d'effet sur la croissance d'E. coli.

Afin de suivre la croissance bactérienne dans chaque puits, nous avons ensuite incubé la microplaque dans un lecteur automatique d’absorbance (ou densité optique) à 600 nm qui  réalisé des mesures toutes les heures pour chaque puits pendant 40 h. La plaque était maintenue à 30°C à l'intérieur du lecteur (Figure 16).

Le principe de la mesure de la densité optique est expliqué sur la Figure 17.

 

Figure 14 : Ajout du milieu de culture avec Escherichia coli dans les puits de la microplaque au moyen d'une micropipette multicanaux.

 

Figure 15 : Ajout des différents volumes de chaque huile essentielle au  moyen d'une micropipette

 

Figure 16 : La microplaque est placé dans un lecteur afin de mesuré la densité optique de chaque puits de manière automatique.

 

Figure 17 : Explication de la mesure de l'absorbance (ou densité optique) au travers d'une solution afin de nous renseigner sur la concentration bactérienne

 

Résultats

A partir des données de densité optique mesurées au cours du temps, nous avons pu faire des graphiques permettant de visualiser la croissance bactérienne avec les différents volumes d'huiles essentielles ajoutés. La Figure 18 montre un exemple de résultats, où l'on voit que l'augmentation du volume ajouté d'huile essentielle augmente l'inhibition de croissance par rapport aux échantillons contrôles. On voit également sur cet exemple que l'effet bactériostatique de l'huile essentielle de l'arbre à thé est plus fort que celui de l'eucalyptus extrait au lycée.

L'ensemble des figures de croissance est disponible en cliquant ici.

 

 

Figure 18 : Exemple de croissance d'E. coli mesurée au moyen de la densité optique en fonction du temps avec différents ajouts de l'huile essentielle N°1 (Eucalyptus lycée) et N°3 (Arbre à thé).

 

Afin de classer de manière objective l'efficacité bactériostatique des différentes huiles, nous avons calculé un pourcentage d'inhibition de croissance pour chaque huile après 25 h d'incubation pour le volume d'huile essentielle ajoutée de 1,35 µl.

La formule est la suivante : % inhibition = (valeur DO contrôle – valeur DO HE) x100 / valeur DO contrôle

Les résultats de ces calculs sont présentés sur la Figure 19. On peut donc dire que les huiles essentielles se classent par ordre décroissant d'effet bactériostatique de la manière suivante :

HE3 Arbre à thé > HE5 Lavandin super > HE4 Eucalyptus globulus > HE2 Lavande lycée > HE1 Eucalyptus lycée

 Ce résultat est assez logique, sachant que les huiles essentielles du commerce étaient plus concentrées que celles que nous avons produites au lycée. Comme indiqué sur la fiche signalétique de l'huile essentielle de l'arbre à thé, cette huile est connue pour son action antibactérienne à large spectre, et se retr

Figure 19 : Inhibition de croissance calculée pour les différentes huiles essentielles après 25h d'incubation et pour un volume ajouté de 1,35 µl. HE1 : Eucalyptus lycée ; HE2 : Lavande lycée ; HE3 : Arbre à thé ; HE4 : Eucalyptus globulus ; HE5 : Lavandin super

2. Expérience d'inhibition de croissance d'E. coli sur milieu solide (aromatogrammes)

Mode opératoire

Sous une hotte microbiologique qui assure la stérilité, nous avons étalé des fractions de 100 µL d’une suspension E. coli (environ 108 bactéries/ml) à la surface de plusieurs boîtes de gélose nutritive (Figure 20). Nous avons suite placé des disques antibiotiques, ou des disques imprégnés d’une ou de 2 huiles essentielle ou bien encore des disques antibiotiques imprégnés de 1 ou 2 huiles essentielles à la surface de la gélose. Si une seule huile essentielle est utilisée, le disque est imprégné d’un volume de 5 µl. Si deux huiles sont utilisées, le disque est imprégné de 2,5 µl de chaque huile.

Après avoir placé 3 à 4 disques par boites (Figure 21), celles-ci sont fermées par un couvercle et placées dans une étuve microbiologique de 30°C pendant 24h (Figure 22). Les boites sont alors récupérées et scannées. Nous avons ensuite mesuré le diamètre d’inhibition autour de chaque disque à partir des photos. Pour connaître le diamètre réel, nous avons fait une règle de 3 sachant que la boite à un diamètre de 90 mm.

 

 

Figure 20 : Etalement au moyen d'un râteau de la culture d'Escherichia coli à la surface de milieu de culture gélosé. Le travail est réalisé de manière stérile sous une hotte à flux laminaire.

 

Figure 21 : Dépôt des disques antibiotiques et des disques imprégnés d'huiles essentielles

 

Figure 22 : Incubation des boites de culture dans une étuve à 30°C.

 

Nous avons utilisé en tout 5 antibiotiques différents qui sont présentés dans le tableau 1.

 

Tableau 1 : Liste des antibiotiques que nous avons utilisés lors de notre expérience.

 Antibiotique

 Concentration

(disque)

 Diametre

critique (mm)

 Famille

 Cible

 Rifampicine

 30 µg

24 

 Rifamycines

 Action RNA polymérase

 Ampicilline

 10 µg

16

 Penicillines

 Transpeptidase (Paroi)

 Tetracycline

 30 µg

21

 Tetracyclines

 Ribosome (aminoacyl-ARNt)

 Erythromycine

 15 µg

17

 Macrolides

 Protéines

 Streptomycine

 10 µg

12

 Aminosides

 Synthèse protéique

Si diamètre observée < diamètre critique, alors la bactérie est résistante.

Si diamètre observée > diamètre critique, alors la bactérie est sensible.

Si diamètre observée = diamètre critique, alors la bactérie est dite intermédiaire.

Résultats

Après 24 h,nous avons pu mesurer les différents diamètres d'inhibition sur les boites (Figure 23).

Figure 23 : Photographie de boites de culture avec les zone d'inhibition autour des disques antibiotiques (ici rifampicine, streptomycine, ampiciline) avec et sans huiles essentielle.

 

A partir des différentes mesures de diamètre d'inhibition sur les photographies, nous avons créé un fichier Excel afin de calculer les diamètres réels puis les surfaces d'inhibition en rentrant des formules dans les cellules.

Le fichier de calcul final est disponible en cliquant ici.

 

Tout d'abord, en comparant les diamètres d'inhibition autour des disques avec seulement 1 huile essentielle, il est possible de classer l'importance de l'effet bactériostatique par ordre décroissant :

HE3 Arbre à thé (19,5 mm) > HE5 Lavandin super (14,6 mm) > HE4 Eucalyptus globulus (12,2 mm) > HE2 Lavande lycée (0 mm) = HE1 Eucalyptus lycée (0 mm)

 

Cet ordre respecte ce que l'on avait trouvé dans l'expérience précédente en milieu liquide.

Ensuite, en ce qui concerne les antibiotiques, en comparant nos diamètres mesurés par rapport au diamètre critique (Tableau 1), nous pouvons conclure que E. coli est sensible à l’ampicilline, à la rifampicine, à l’érythromycine et à la tétracycline et résistante à la streptomycine.

Enfin, dans le cas des combinaisons qui ont été testées uniquement avec les huiles du commerce (celles qui ont le plus d'effet bactériostatique), nous avons comparé la surface observée par rapport à la surface attendue. La surface attendue correspond à celle calculée en additionnant les surfaces de chaque produits (huile ou antibiotique).

 

Pour conclure sur l'effet des combinaisons, nous avons fixé les seuils suivants :

Additionnel : surf. observée / surf. attendue = 0,5-1,5

Synergie : surf. observée / surf. attendue > 1,5

Antagoniste : surf. observée / surf. attendue <0,5

En mélangeant 2 huiles (HE3+H4, HE3+HE5 ou HE4+HE5), on observe un effet de synergie très important. Cela signifie que deux huiles essentielles mélangées ont beaucoup plus d'efficacité que la simple addition de l'effet de chacune de ces huiles. Cela pourrait s'expliquer par des cibles différentes pour chacune des huiles et que lors de leur mélange, les bactéries seraient beaucoup plus fragilisées.

Lorsqu'un antibiotique est mélangé à 1 huile essentiel, l'effet est additionnel dans tous les cas. En revanche, lorsqu'un antibiotique est mélangé à 2 huiles essentielles, on retrouve plusieurs cas de synergie :

HE3+HE4+streptomicine

HE4+HE5+streptomicine

HE4+HE5+erytromicine

HE3+HE5+tetracycline

Ces résultats semblent indiquer que l'on peut augmenter la sensibilité d'une bactérie à un antibiotique (même ceux pour lesquels la bactérie était résistante au départ comme la streptomcyne) en le combinant à deux huiles essentielles.

08/03/18

Traductions :